• NSND Ngọc Giàu vào vai bà Ngọc Ngà, một nhân vật lớn tuổi nhưng cá tính. Bà đam mê những mẫu đầm hoa trẻ trung, tóc nhuộm màu sáng, khi búi cao, khi tết sợi mảnh cá tính.[1][2]
• Lê Giang vào vai bà Ngọc Nữ, chủ một gia đình ba thế hệ toàn phụ nữ. Bà Nữ tháo vát, chăm lo cho mẹ và hai con gái. Bà là đại diện cho người phụ nữ truyền thống, ăn mặc kín cổng cao tường, khó tính và đanh đá.[3] Từng bị phụ bạc nên bà không thích đàn ông.[4] Theo tiết lộ của đạo diễn - nhà sản xuất Trấn Thành, vai bà Nữ lấy cảm hứng từ người phụ nữ bán bánh canh cua giá 300.000 đồng gây tranh cãi trên mạng xã hội.[3][5]
• Khả Như vào vai Ngọc Như, chủ một tiệm bánh canh cua nổi tiếng ở Thành phố Hồ Chí Minh. Cô yêu và kết hôn với Phú Nhuận. Ngọc Như có tạo hình sặc sỡ, màu mè, bản tính thích khoe giàu khi đeo vàng và nữ trang đầy người. Không chỉ thế, cô nàng này còn nhuộm tóc tết bím không khác gì "chị đại" khu phố.[6]
• Uyển Ân vào vai Ngọc Nhi, thiếu nữ xinh đẹp với cá tính mạnh mẽ và cũng người người nhỏ nhất trong gia đình.[7]
• Trấn Thành vào vai Phú Nhuận, chồng của Như, "cánh mày râu" duy nhất trong gia đình và thường xuyên bị réo sai việc vặt như cơm bữa.[7] Tuy nhiên, anh chàng này có thói quen hay bia, rượu.[4]
• Song Luân vào vai John, một trong hai chàng trai đang ngỏ ý quen Uyển Ân.[4][8]
• Lý Hạo Mạnh Quỳnh vào vai Quỳnh, một trong hai chàng trai đang ngỏ ý quen Uyển Ân.[4][8]

Phim còn có sự góp mặt của NSND Việt Anh, Lê Dương Bảo Lâm,[9] NSƯT Công Ninh, Ngân Quỳnh, Phương Lan... Không giống như bộ phim điện ảnh Bố già, trong dự án Nhà bà Nữ, Trấn Thành chỉ vào vai tuyến nhân vật phụ và tập trung làm đạo diễn.[10][11]